61.   Реакции с участием комплемента. Реакция связывания комплемента. Механизм, компоненты, способы постановки, применение. Реакция радиального гемолиза

Реакции с участием комплемента

Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента комплексом анти­ген—антитело (реакция связывания компле­мента, радиального гемолиза и др.).

Реакция связывания комплемента (РСК) за­ключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммун­ный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т.


происходит связывание комплемента комп­лексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комп­лемент остается свободным (рис. 13.8). РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (инди­каторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли­тической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содер­жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антите­ло происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован­ных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и ан­титело не соответствуют друг другу (в иссле­дуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — ан- тиэритроцитарное антитело, вызывая гемо­лиз; реакция отрицательная.

РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифи­лиса (реакция Вассермана).

Эту реакцию применяют для обнаружения антител в сыворотке крови больных при бактериальных, вирусных, протозойных инфекциях, а также для определения и типирования вирусов, выделенных у больных.


К относится к сложным серологическим реакциям, в которых, кроме антигена, антитела и комплемента, участвует еще и гемолитическая система, выявляющая результаты реакции. РСК протекает в две фазы: первая — взаимодействие антигена с антителом при участии комплемента и вторая — выявление степени связывания комплемента при помощи гемолитической системы. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, полученной путем иммунизации лабораторных животных, эритроцитами. Эритроциты обрабатывают — сенсибилизируют, присоединяя к ним сыворотку при температуре 37°С, в течение 30 мин. Лизис сенсибилизированных эритроцитов барана наступает только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. В отсутствие его эритроциты не изменяются. Результаты РСК зависят от наличия в исследуемой сыворотке антител. Если сыворотка содержит антитела, гомологичные антигену, используемому в реакции, то образующийся комплекс антиген — антитело присоединяет, связывает комплемент. При добавлении гемолитической системы в этом случае гемолиза не произойдет, так как весь комплемент расходуется на специфическую связь комплекса антиген — антитело. Эритроциты остаются не измененными, поэтому отсутствие гемолиза в пробирке регистрируют как положительную РСК. При отсутствии в сыворотке антител, соответствующих антигену, специфический комплекс антиген — антитело не образуется и комплемент остается свободным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и вызывает гемодиз эритроцитов. Разрушение эритроцитов, их гемолиз характеризует отрицательную реакцию.


Для постановки РСК необходимы: сыворотка больного, комплемент, гемолитическая система, состоящая из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, а также изотонический раствор хлорида натрия. Реакцию ставят в серологических пробирках. Эритроциты барана получают из дефибринированной крови барана путем троекратного отмывания их изотоническим раствором хлорида натрия. Гемолитическую сыворотку выпускают в готовом виде в ампулах, на этикетке которых указан ее титр, т. е. максимальное разведение сыворотки, которое еще вызывает гемолиз при добавлении к эритроцитам в присутствии комплемента. Гемолитическую сыворотку получают путем иммунизации животных, например кролика эритроцитами барана. При постановке реакции сыворотку используют в тройном титре. Например, титр гемолитической сыворотки 1 : 1200, а рабочее разведение 1 : 400. В качестве комплемента используют свежую сыворотку крови морской свинки (в течение 24—48 ч) или сухой комплемент в ампулах. Предварительно перед постановкой РСК комплемент разводят 1 : 10 и титруют для установления титра — наименьшего количества комплемента, которое дает гемолиз эритроцитов при соединении с гемолитической системой, используемой в данной реакции. Учитывая возможные антикомплементарные свойства антигена, при постановке реакции к установленному рабочему титру комплемента делают 20—30% надбавку.
Антигеном для РСК являются взвеси убитых бактерий, экстракты, приготовленные из этих взвесей, отдельные химические фракции микробов.


новное требование к антигену — отсутствие угнетения активности комплемента. Он не должен обладать антикомплементарными свойствами. Для выявления этих свойств антигена комплемент дополнительно титруют в присутствии используемого в реакции антигена. Существуют определенные схемы постановки РСК. Результаты реакции учитывают по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов в гемолитической системе. РСК применяют при диагностике сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде—Жангу), токсоплазмоза, риккетсиозных и вирусных заболеваний.

Реакцию радиального гемолиза (РРГ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эрит­роциты барана и комплемент. После внесе­ния в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии анти­тел) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, крас­нухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после че­го к этому комплексу присоединяются ком­поненты комплемента, вызывая гемолиз.

Источник: www.sites.google.com

Ингредиенты реакции


Ингредиенты реакции: антигены, испытуемая сыворотка, эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент.

Антигены. Первоначально в качестве антигена пользовались водной взвесью печени погибшего внутриутробно пораженного сифилисом плода (антиген, предложенный А. Вассерманом). Были рекомендованы также другие антигены: специфические и неспецифические. К специфическим относят антигены из бледной трепонемы:

1) взвеси апатогенной культуры бледной трепонемы (водные, карболизированные, алкоголизированные); наибольшее применение получила взвесь культуральной трепонемы штамма Рейтера, обработанная ультразвуком (соникат);

2) протеиновая фракция (более чувствительна, чем полисахаридная и липоидная) из культуры трепонемы [д’Алессандро и Пуччинелли (G. D’ Alessandro, V. Puccinelli)];

3) взвеси патогенной тканевой трепонемы из пораженного яичка кролика, зараженного сифилисом. Предложение пользоваться специфическими антигенами исходило из представления о том, что RW основана на взаимодействии специфических антител с антигенами возбудителя.

К неспецифическим антигенам относят: 1) спиртовой экстракт из мышцы бычьего сердца (1 часть мышцы, 5 частей спирта с добавлением 0,25— 0,3% холестерина); 2) кардиолипиновый антиген [Пангборн (M.Pangborn), Л. С. Резникова и др.]; кардиолипин — очищенный экстракт из мышц бычьего сердца (фосфолипида — 0,0175%, лецитина — 0,0875%, которые проявляют активность при добавлении холестерина — 0,3%); антиген отличается высокой чувствительностью, особенно при скрытых формах сифилиса; широко применяется в серодиагностике сифилиса во всем мире (в СССР его применение обязательно); 3) так наз.


кусственные липоидные антигены, приготовленные из холестерина, лецитина и олеиновокислого натрия, оказались малопригодными; антигены, изготовленные из растительных веществ (ситолипины), не вошли в практику.

Антигены для RW должны удовлетворять следующим требованиям:

1) не вызывать гемолиза эритроцитов; 2) не инактивировать и не адсорбировать комплемент; 3) не образовывать с сывороткой здоровых лиц комплекса, способного адсорбировать комплемент; 4) при добавлении антигена в оптимальной дозе к сыворотке больных сифилисом образовывать комплекс, адсорбирующий комплемент.

Испытуемая сыворотка по классической методике R W предварительно прогревается в водяной бане 30 мин. при t° 56° для инактивирования комплемента и стабилизации глобулиновых фракций.

Методические требования к постановке основного опыта

Ввиду того, что результаты реакции учитываются по отсутствию или наличию гемолиза после прибавления гемолитической системы, основным методическим требованием RW является применение точно оттитрованной дозы комплемента с таким расчетом, чтобы в случае адсорбции комплемента при взаимодействии испытуемой сыворотки с антигеном не остался излишек комплемента в количестве, достаточном для растворения эритроцитов, сенсибилизированных гемолитической сывороткой; с другой стороны, доза комплемента не должна быть слишком мала, чтобы обеспечить гемолиз эритроцитов в случае отсутствия реакции между исследуемой сывороткой и антигеном.


этому перед постановкой основного опыта минимальная доза комплемента, вызывающая гемолиз при добавлении гемолитической системы, оттитровывается в присутствии антигена и нормальной сыворотки. В основном опыте комплемент применяется с нек-рой надбавкой (не менее 15—30%). Каждый из 5 ингредиентов реакции (испытуемая сыворотка, антиген, комплемент, взвесь бараньих эритроцитов и гемолитическая сыворотка) применяется в одинаковом объеме (напр., по 0,25 мл). Для обеспечения оптимальных условий фиксации комплемента на образующемся комплексе в случае взаимодействия исследуемой сыворотки с антигеном смесь сыворотки, антигена и комплемента выдерживают в термостате в течение 45—60 мин. (1-я фаза реакции), после чего добавляют гемолитическую систему и пробирки вновь помещают в термостат (2-я фаза).

Одновременно ставят 3 контрольных опыта, в одном из которых антиген заменяется изотоническим раствором хлорида натрия, а в другом исключается исследуемая сыворотка, в третьем исследуется заведомо положительная по RW сыворотка. Учет реакции производится при наступлении гемолиза в контрольных пробирках основного опыта.

Методы постановки реакции

В зависимости от характера ингредиентов реакции, количественных соотношений между ними и условий проведения опыта различают следующие модификации RW.


1. Количественные методы: а) постановка опыта с постоянными дозами сыворотки и комплемента и с разными дозами антигена; б) проведение опыта с повышающимися дозами комплемента; в) проведение опыта с постоянными дозами антигена и комплемента и с разными дозами исследуемой сыворотки: последний метод широко применяется в практике.

2. RW при связывании на холоде — первая фаза реакции проводится при t° 2—4° в течение 18—20 час., что значительно увеличивает ее чувствительность (реакция Колмера, получившая особенно большое применение).

3. Активные методы реакции, которые основаны на использовании естественного комплемента или гемолизина, или того и другого, содержащихся в испытуемой сыворотке (Н. А. Черногубов, 1908; Н. В. Нарциссов, 1952). Наибольшее применение в СССР получили ускоренные активные методы постановки RW — реакция Григорьева — Рапопорта (см. Григорьева-Рапопорта реакция), активная модификация Вайнштейна — Резниковой. В основу последней положен принцип использования естественного комплемента и гемолизина исследуемой сыворотки человека. Для выполнения реакции необходимы: активная (не прогретая при t° 56°) исследуемая сыворотка, не более 24-часовой давности; два антигена разных серий (из обычно применяемых в RW), разведенные по утроенному титру, и 1% взвесь неотмытой дефибринированной крови барана. В три пробирки отмеривают по 0,2 мл активной испытуемой сыворотки: в первую и вторую пробирки — по 0,3 мл разведенных антигенов, а в третью (контрольную) — 0,3 мл изотонического раствора хлорида натрия. Пробирки встряхивают в течение 3 мин., добавляют по 0,75 мл 1% взвеси неотмытой крови барана; после 45—60 мин. стояния при комнатной температуре (18— 25°) учитывают результат.


Серодиагностика сифилиса в СССР осуществляется при помощи комплекса реакций (см. Сифилис). В республиканских, областных и крупных районных центрах необходима постановка комплекса стандартных реакций, состоящего из RW и двух осадочных реакций — Закса — Витебского и Кана (см. Закса-Витебского реакция, Кана реакция). В других районных центрах, где невозможна постановка комплекса стандартных реакций, допускается постановка ускоренного упрощенного комплекса (активная модификация + две осадочные реакции). При исследовании крови доноров, согласно инструкции М3 СССР, применяется ускоренный комплекс реакций на сифилис, состоящий из активной модификации и двух микрореакций на стекле:

а) с кардиолипиновым антигеном;

б) с цитохолевым антигеном и в экстренных случаях — микрореакция со свежей каплей крови.

Для объяснения механизма реакции Вассермана предложено несколько теорий. Амбоцепторная теория рассматривает R W как истинную реакцию иммунитета между антигеном и специфическими антителами сыворотки больного. По вопросу о характере взаимодействующих антигена и антител были высказаны различные мнения.


основном считается, что речь идет об антигенах бледной трепонемы и соответствующих антителах. В антигенном составе бледной трепонемы обнаруживают не менее четырех антигенов: протеиновый, полисахаридный и два липоидных, один из двух последних специфичен для трепонемы, другой — из числа широко распространенных в природе. В сыворотках больных удается дифференцировать три вида специфических антител (антипротеиновые, антиполисахаридные, антилипоидные) и реагины (белково-липоидные соединения, формирующиеся в ответ на липоидный антиген трепонемы, широко распространенный в природе). Этим объясняется возможность постановки RW с различными антигенами (специфическими и неспецифическими, водными и спиртовыми).

Физ.-хим. теория объясняет RW как результат изменений сыворотки у больных сифилисом, что характеризуется увеличением гамма-глобулиновой фракции, повышением концентрации водородных ионов, увеличением поверхностного натяжения и вязкости, уменьшением дисперсности коллоидов, лабильностью глобулинов ввиду ослабления связи с окружающей средой и в связи с этим легкой осаждаемостью их при добавлении антигена.

По-видимому, наиболее правильна концепция, что RW обусловлена иммунологическими и физ.-хим. факторами.

Наблюдающиеся при ряде болезней, при некоторых физиол, состояниях (беременность) и у здоровых лиц положительные R W побуждали изыскивать способы повышения ее специфичности. Были предложены реакции, исключающие или, наоборот, подтверждающие сифилитическую природу заболевания в спорных случаях [Нейрат (H. Neurath), 1948; Кан (R. Kahn), 1952, и др.]. Однако эти реакции технически сложны и не полностью дифференцируют положительную RW от ложноположительной.

Для подтверждения специфичности RW предложен ряд серореакций с применением в качестве антигена патогенной тканевой бледной трепонемы. К ним относятся: 1) реакция связывания комплемента с антигеном, который получают путем экстрагирования из вирулентных трепонем 0,2% раствором дезоксихолата натрия [Портной и Магнусон (J. Porthnoy, H. Magnuson), 1955]; 2) реакция агглютинации, для к-рой вирулентную трепонему прогревают при t° 56° [Эрманн и Нильсен (G. Ehrmann, H. Nielsen), 1955]; 3) реакция иммобилизации Нельсона — Мейера (см. Нельсона-Мейера реакция), к-рая состоит в том, что вирулентная трепонема теряет свою подвижность в присутствии сифилитической сыворотки и комплемента; тест Нельсона — Мейера отличается высокой специфичностью, но достаточно сложен; 4) реакция «прилипания» (Treponema pallidum immune-adherens test), сущность которой заключается в том, что вирулентная бледная трепонема, сенсибилизированная антителами сифилитической сыворотки, облепляет поверхность эритроцитов человека в присутствии комплемента [Нельсон (R. Nelson), 1953]; однако и эти реакции дают иногда положительный результат у здоровых лиц и отрицательный — у больных свежими формами сифилиса; 5) реакция иммунофлюоресценции (см. Иммунофлюоресценция); антиген из патогенных бледных трепонем и сыворотка больного сифилисом образуют комплекс, к к-рому добавляют кроличью люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека; при исследовании в люминесцентном микроскопе сыворотка больного сифилисом дает желто-зеленое свечение трепонем.

Стандартизации RW посвящено много отечественных и зарубежных работ. В СССР инструкция по постановке RW была утверждена на XI съезде бактериологов и эпидемиологов в 1928 г., пересмотрена и дополнена в 1956 и в 1973 г.

Разливка ингредиентов. Точность разливки ингредиентов имеет первостепенное значение для исхода реакции. Из предложенных аппаратов особого внимания заслуживает аппаратура А. В. Флоринского. Она состоит из следующих частей.

1) Резиновые штативы, представляющие собой резиновые планки (9 X 23 см) с 40 отверстиями, в которые плотно вставлены 40 пробирок (14X65 мм); каждый штатив рассчитан на исследование 10 сывороток с тремя антигенами, четвертый ряд предназначен для контролей сывороток; пробирки, не вынимая из планки, моют ершом в теплой воде и просушивают в сушильном шкафу при t° 120—130°.

2) Разборно-планочные штативы могут быть использованы для сливания и инактивации исследуемых сывороток, для постановки осадочных реакций и количественного метода RW; в штативе 10 планок (они могут быть резиновыми, деревянными, металлическими или из плексигласа), всего в штативе 100 пробирок (рис.).

3) Стеклянные мерные приборы с пипетками для разливки ингредиентов, содержащие по 10 пипеток емкостью в 0,025; 0,05, 0,1; 0,15; 0,25; 0,5; 1,0 мл; после разливки каждого ингредиента приборы промывают изотоническим раствором хлорида натрия; по окончании работы — сначала водопроводной, затем дистиллированной водой.

При пользовании аппаратурой Флоринского на разливку 200 сывороток требуется лишь 20 мин.

Практическое значение реакции Вассермана

Профилактические мероприятия, вопросы диагностики, оценка результатов терапии и т. д. не могут в наст, время решаться без постановки серологических реакций, среди которых R W занимает одно из важных мест. В СССР в качестве стандартных реакций применяется комплекс серологических реакций (RW с двумя или тремя антигенами и две осадочных: Кана и цитохолевая). Такой комплекс позволяет более точно устанавливать диагноз. Повторно положительная R W в высоком титре, произведенная квалифицированны м серологом, в большинстве случаев указывает на наличие сифилиса, несмотря на отсутствие иногда клинических проявлений. Особенно большое значение R W имеет: 1) в первичном периоде сифилиса для уточнения диагноза и установления длительности сроков лечения и наблюдения за больными, хотя деление первичного сифилиса на серонегативный и серопозитивный (см. Сифилис) условно, т. к. при применении более чувствительного метода, напр, постановки реакции на холоде, положительные результаты удается выявить раньше: 2) при скрытом сифилисе, когда клинические проявления отсутствуют, и только серологические реакции нередко помогают диагностировать его; 3) при заболеваниях внутренних органов и нервной системы для исключения возможной сифилитической инфекции; 4) при профилактике сифилиса (обследование членов семьи больного и лиц, находившихся с ним в контакте, персонала детских учреждений, работников пищевых и коммунальных предприятий, доноров и т. д.); 5) при снятии с учета больных сифилисом; 6) при всех заболеваниях с неясной этиологией, подозрительных на сифилис; 7) при оценке эффективности проводимой терапии; 8) в суд.-мед. практике, в частности при исследовании трупной крови.

RW у больных первичным сифилисом в первые 15 —17 дней заболевания отрицательна, на 5 — 6 нед. положительные результаты наблюдаются у 25% больных, к 7—8 нед.— у 75—80%, у больных вторичным свежим сифилисом R W становится положительной в 100% случаев, при вторичном рецидивном в 95 — 100% случаев, у больных скрытым сифилисом RW положительна в 40—96% случаев в зависимости от длительности заболевания, интенсивности предшествующей терапии и т. д., у больных третичным сифилисом R W положительна в 75—80% случаев, у больных сифилисом головного мозга в 60—70%, при прогрессивном параличе — в 100%, при спинной сухотке — ок. 60%, при раннем врожденном сифилисе RW положительна около 100%, при позднем — в 70—80% случаев.

Однако не всегда положительная RW указывает на наличие сифилиса. Положительную реакцию можно иногда получить и у здоровых лиц, а также при заболеваниях, при которых изменения в сыворотке крови близки к таковым у больных сифилисом. Положительные результаты RW у лиц, не страдающих сифилисом, называют ложноположительными или неспецифическими. Ложноположительные результаты серологических реакций могут наблюдаться при заболеваниях (возвратный тиф, фрамбезия, беджель, пинта, лептоспироз и др.), обусловленных наличием общих антигенов у сходных возбудителей, — так наз. групповые реакции. При этих заболеваниях вырабатываются антитела, сходные с таковыми при сифилисе. Ложноположительные результаты могут быть обусловлены нарушением обмена (в первую очередь липидного) и изменением в глобулинах сыворотки. Иногда наблюдаются положительные результаты R W у больных подагрой, малярией, сыпным тифом, скарлатиной, оспой, пузырчаткой, эндокардитом, при отравлениях свинцом, фосфором, хлороформом и др. Неспецифические положительные результаты реакции иногда возникают из-за технических погрешностей при ее постановке. Отмечаются также так наз. парадоксальные реакции, когда с одной и той же сывороткой в одно и то же время в разных лабораториях получают противоречивые результаты, что объясняется применением различных ингредиентов при постановке реакции. В наст, время, когда методики изготовления антигенов и постановки реакции унифицированы, парадоксальные реакции встречаются редко. Особенно большой процент ложноположительных результатов R W наблюдается у больных туберкулоидной лепрой (Н. А. Торсуев). Возможна положительная R W у больных системной красной волчанкой, листереллезом, железистой лихорадкой, туберкулезом, гриппом, корью, пневмонией, злокачественными опухолями в стадии распада, ангиной Плаута — Венсана, мягким шанкром, а также непосредственно после эфирного и хлороформного наркоза. Могут наблюдаться слабоположительные и сомнительные результаты, особенно с сыворотками крови детей, при жел.-киш. расстройствах, у женщин во время менструаций, непосредственно перед и после родов. Процент ложноположительных RW у беременных в среднем ок. 2%, но некоторые авторы считают эти результаты с сыворотками беременных погрешностью лабораторной техники. Однако ложноположительные результаты серологических реакций с сыворотками беременных являются фактом, с к-рым следует считаться, т. к. это имеет физиол, обоснование.

Неспецифические результаты RW описаны при взятии крови для исследования у лихорадящих больных, непосредственно после принятия обильной жирной пищи, алкоголя. Следует учитывать, что сыворотки больных подострым септическим эндокардитом обладают самозадерживающими свойствами (задержка гемолиза в контрольных пробирках основного опыта).

Основными реакциями, которые дают возможность отличить ложноположительные реакции от реакций, обусловленных сифилисом, являются реакция иммобилизации бледных трепонем и реакция иммунофлюоресценции. Однако и они в отдельных случаях могут быть неспецифическими. Следует проявлять осторожность при оценке ложноположительных результатов реакции: их переоценка или недооценка могут привести к серьезным диагностическим ошибкам. В каждом конкретном случае надо учитывать клинические и серологические данные, притом проведенные повторно. Не следует переоценивать и значения определения высоты титра RW, т. к. это имеет лишь вспомогательное значение. В оценке проводимого лечения важным показателем эффективности терапии сифилиса является переход положительных серологических реакций в отрицательные. Однако если у больных свежими формами сифилиса R W сравнительно быстро становится отрицательной, то при лечении больных поздним сифилисом негативация наступает более медленно и нередко совсем не наступает, несмотря на достаточное лечение (серорезистентный сифилис). В этих случаях следует выяснить причины серорезистентности, привлекая к обследованию больных других специалистов (невропатологов, офтальмологов, терапевтов, рентгенологов и др.). Кроме сыворотки крови, необходимо исследование цереброспинальной жидкости. Если R W остается в них положительной, следует провести дополнительное лечение с применением одновременно неспецифических методов терапии. Если и после этого RW остается положительной, лечение прекращают и больного оставляют под клиническим и серологическим контролем.

В середине 70-х гг. в ряде стран (США, Англия и др.) оригинальной RW почти не пользуются, заменив ее быстрой реакцией на стекле с кардиолипиновым антигеном (реакция VDRL — название по начальным буквам лаборатории, в к-рой она впервые предложена) с последующей постановкой (в случае ее положительных результатов) реакции иммобилизации трепонем или реакции иммунофлюоресценции.

Вассермана реакция у детей

Вассермана реакция у детей имеет важное значение при распознавании активных форм врожденного или приобретенного сифилиса, и особенно при диагностике скрытого врожденного сифилиса. В связи с особенностями белкового спектра сыворотки крови в грудном возрасте у 3—6% детей, страдавших активным врожденным сифилисом, R W может быть отрицательной (Ю. А. Финкельштейн, М. М. Райц). Еще чаще наблюдается отрицательная R W при позднем врожденном сифилисе.

Не являясь строго специфической реакцией, RW может быть положительной при других заболеваниях (скарлатина, инфекционный мононуклеоз, эозинофильный легочный инфильтрат, некоторые формы пневмонии, системная красная волчанка, малярия, при увеличении в крови количества патологических глобулинов, иногда после противооспенных прививок или прививок коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакциной). Неспецифический характер R W доказывается отрицательной реакцией иммобилизации бледных трепонем (РИТ), иммунофлюоресценцией бледных трепонем и тщательным клиническим обследованием детей и их матерей.

Неспецифическая положительная R W может возникнуть через 7— 10 дней после рождения. В таких случаях необходимо повторное серологическое исследование через месяц после рождения и тщательное клиническое обследование.

У некоторых детей, родившихся от матерей с положительными RW, достаточно леченных по поводу сифилиса, возможен пассивный перенос сифилитических реагинов от матери. Если ребенок здоров, то обычно через 2—5 мес. RW постепенно становится отрицательной.

В результате лечения пенициллином у подавляющего большинства детей, больных активным врожденным или ранним скрытым врожденным сифилисом, RW постепенно становится отрицательной. Значительно медленнее это явление происходит у детей, больных рецидивным приобретенным сифилисом или поздним врожденным сифилисом. У части таких детей RW длительное время остается стойко положительной.

См. также Реакция связывания комплемента.

Библиография: Бухарович М. Н. Серо-резистентний сифш1с (Патогенез, лшуван-ня, профшактика), Кшв, 1971, библиогр.; Овчинников H. М. Серологические исследования при сифилисе и гонорее, М., 1958, библиогр.; Овчинников H. М. и Сазонова Л. В. Серодиагностика сифилиса, в кн.: Унифицированные методы клин. Лаборат, исследований, под ред. В. В. Меньшикова, в. 4, с. 193, М., 1972; Райц М. М. Врожденный сифилис, Многотомн, руководство по дерм, и вен., под ред. С. Т. Павлова, т. 1, с. 308, М., 1959, библиогр.; Резникова Л. С. Кардиолипиновые антигены в серодиагностике сифилиса, Сов. мед., № 1, с. 40, 1953; Торсуев Н. А. Лепра, М., 1952; Финкельштейн Ю. А. Серодиагностика сифилиса, венерических и кожных болезней и их иммунотерапия, М.— Л., 1930, библиогр.; Gertler W. Systematische Dermatologie und Grenzge-biete, Bd 2, Lpz., 1972; Gumpesber-ger G. Die Lues connata, в кн.: Dermatol. u. Venerol., hrsg. v. H. A. Gott-ron u. W. Schonfeld, Bd 5, T. 2, S. 9 75, Stuttgart, 1965, Bibliogr.; W asser-m a n n A., N e i s s e r A. u. B r u с k C. Eine serodiagnostische Reaktion bei Syphilis, Dtsch. med. Wschr., S. 745, 1906.

Источник: xn--90aw5c.xn--c1avg

Определение

Сифилис – общее инфекционное заболевание, вызываемое бледной трепонемой, склонное к хроническому рецидивирующему течению с характерной периодизацией клинических симптомов, способное поражать все органы и системы, передающееся преимущественно половым путем; может передаваться внутриутробно.

Этиология

Возбудитель сифилиса – бледная трепонема, была открыта в 1905 г. Schaudinn и Hoffmann. По классификации Bergey она относится к отделуGracillicutes, порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetoceae, роду Treponema, виду Treponema pallidum, подвиду pallidum.

Род Treponema представлен спиральными бактериями длиной от 5 до 20 мкм, которые образуют туго закрученные правильные или неправильные спирали. Грамотрицательные хорошо окрашиваются серебрением по Морозову, но плохо по Романовскому–Гимзе.

Представители рода – хемоорганотрофы с бродильным метаболизмом, утилизируют аминокислоты и/или углеводы. По типу дыхания – анаэробы или микроаэрофилы. Ферментативная активность очень низкая: каталаза-, уреаза- и оксидазаотрицательны, не восстанавливают нитраты.

Лабораторная диагностика сифилиса

Сифилис весьма многолик, характеризуется богатой палитрой манифестных и латентных форм, полисиндромностью поражений, распознавание которых основывается на комплексном клинико-лабораторном обследовании больного.

Выбор материала для исследования и метода микробиологической диагностики определяется стадией патогенеза болезни. 1 период заболевание – отделяемое шанкра, 2 период – аспират из высыпных элементов, пунктат регионарных лимфатических узлов, 2,3,4 периоды – кровь, 4 период – СМЖ (нейросифилис).

Бактериологическое исследование обычно не проводят, так как доступные методы выделения чистой культуры возбудителя не разработаны.

В связи с тем, что возбудитель сифилиса – Treponema pallidum – в отличие от других микроорганизмов плохо культивируется на питательных средах invitro, а также слабо воспринимает анилиновые красители, все существующие методы ее обнаружения можно подразделить на прямые и непрямые.

Прямые тесты основаны на непосредственном выявлении возбудителей в очагах поражения. К ним относятся: темнопольная микроскопия, RIT (rabbitinfektivitytest) – заражение материалом от больных кроликов, прямой тест с флюоресцентными антителами. Непрямые тесты основаны на выявлении АТ к возбудителю сифилиса в сыворотке крови. Это серологическая диагностика, а также редко используемые гистологические исследования.

Все существующие в настоящее время серологические тесты на сифилис подразделяются на две основные группы:

• нетрепонемные [реакция связывания комплемента с кардиолипиновым АГ (РСКк), реакция микропреципитации (РМП), тест быстрых плазменных реагиновRapidPlasmaReagins (RPR), VeneralDiseaseResearchLaboratory (VDRL), тест с толуидиновым красным – ToluidinRedUnheatedSerumTest (TRUST)];

• трепонемные [реакция связывания комплемента с трепонемным АГ (РСКт), реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ или РИТ), реакция иммунофлюоресценции (РИФ) (за рубежом – FTA – Fluorescenttreponemalanibody) с вариантами: РИФ-200 (FTA-200), РИФ-абс (FTA-abs), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) – за рубежом – Treponemapafluidumhaemagglutinationassay (TPHA), иммуноферментный анализ (ИФА) – за рубежом – Enzymelynkedimmunosorbentasay (ELISA), иммуноблоттинг (WesternBlot)].

Прямая визуализация трепонем методом темнопольной микроскопии является убедительным доказательством трепонемной природы заболевания. Наиболее эффективен этот метод при первичном и вторичном сифилисе, наличии поражения кожи и слизистых оболочек. При микроскопии следует дифференцировать Т. pallidum, подвид pallidum, с нитями фибрина, а также с трепонемами нормальной микрофлоры организма человека – Т. refringens и Т. denticola. Т. refringens колонизирует слизистые оболочки наружных половых органов и отличается выраженной подвижностью и отсутствием сгибательных движений. Т. denticola колонизирует слизистую оболочку ротовой полости, ее завитки короче и направлены под более острым углом.

Темнопольная микроскопия обладает чувствительностью 74–86% и специфичностью до 97% в зависимости от квалификации исследователя. Чувствительность может снижаться, если повреждение было протерто антисептиком. Вместе с тем отрицательный результат, обусловленный различными факторами, не является основанием для исключения диагноза сифилиса и требует дальнейшего подтверждения методами серологической диагностики. Кроме того, с помощью этого метода невозможно наблюдать за динамикой инфекционного процесса и оценивать эффективность терапии.

Прямой тест на Т. pallidum с флюоресцентными антителами (DFA-TP) использует флюоресцеинконъюгированные АТ для окраски организма в мазках и срезах тканей. DFA-TP не требует подвижных организмов, является более чувствительным и специфичным, но более дорогим и технически сложным, чем темнопольная микроскопия. На чувствительность обоих микроскопических методов может отрицательно повлиять давность возникновения или состояние повреждения, а также то, получал ли пациент лечение.

Множественный ПЦР с одновременным определением Т. pallidum, вируса герпеса типа 2 и Haemophilisducreyi используется для постановки этиологического диагноза у пациентов с GUD (genitalulcerdisease), а также для обоснования алгоритмов синдромного лечения. Поскольку ПЦР-методики для сифилиса коммерчески недоступны, они остаются инструментом исследователей. Заражение сифилисом лабораторных животных как метод прямой детекции бледной трепонемы не применяется для клинической лабораторной диагностики сифилиса из-за дороговизны, трудоемкости, длительности получения результата, необходимости содержания вивария. Наиболее чувствительным и удобным лабораторным животным для привития сифилиса является кролик. Заражение кроликов производят инокуляцией инфекционного материала в яичко. Чувствительность кроликов к инфекции Treponemapallidum достигает 100%, если во взятом для прививки материале содержится достаточное количество бледных трепонем. В настоящее время он используется только в крупных исследовательских центрах в качестве «золотого стандарта» для оценки чувствительности других тестов.

В нетрепонемных тестах применяется АГ нетрепонемного происхождения (как правило, кардиолипин-лецитин-холестериновый АГ). АТ к фосфолипидным АГ на поверхности трепонем дают перекрестную реакцию с кардиолипиновыми АГ млекопитающих. Флоккуляционные (хлопьеобразующие) методики для обнаружения этих АТ к фосфолипидам были разработаны как неспецифичные скрининговые тесты. К ним относятся РМП и ее модификации: RPR-, VDRL-, TRUST-тест. В данных тестах обнаруживаются IgG- и IgM-АТ к липидам клеточной стенки Т. pallidum, которые появляются в крови примерно через 1 нед после формирования твердого шанкра.

Скрининговые тесты имеют свои плюсы и минусы. К плюсам нетрепонемных тестов можно отнести их невысокую стоимость, сравнительно короткое время для получения ответа при постановке отдельных тестов, пригодность для проведения скрининга большого количества образцов. К минусам большинства нетрепонемных тестов относят их сравнительно низкую чувствительность при первичном (70—90%) и позднем (30—50%) сифилисе, наличие феномена прозоны в отдельных случаях (появление ложноотрицательных или слабоположительных результатов при наличии избыточного количества антител в неразведенной исследуемой сыворотке (блокировка реакции антиген-антитело), в то время как при разведении исходной сыворотки получаются резко положительные результаты). Нетрепонемные тесты дают ложноположительные результаты почти в 2,5% случаев, чаще у женщин. Основные причины ложноположительных нетрепонемных тестов: аутоиммунные заболевания (ревматизм, системная красная волчанка, системная склеродермия, узелковый периартериит, криоглобулиновая пурпура, саркоидоз), онкологические заболевания и болезни крови, некоторые вирусные и бактериальные инфекции, малярия, цирроз печени, наркомании, алкоголизм, беременность, эндокринные заболевания (сахарный диабет, аутоиммунный тиреоидит), старческий возраст и др.

Трепонемные тесты, такие как РСКт, РИБТ или РИТ, РИФ (за рубежом – FTA и FTA-ABS), РПГА (TPHA или ТРРА), используются для подтверждения позитивных скрининговых тестов, распознавания ложноположительных результатов нетрепонемных тестов, при клиническом, эпидемиологическом и анамнестическом подозрении на сифилис, для диагностики скрытых форм заболевания. В трепонемных тестах применяются АГ трепонемного происхождения.

  1. Реакция Вассермана

Самой привычной и испытанной временем является реакция Вассермана (РВ) на сифилис. Для ее проведения берут 5 мл крови из локтевой вены, из пробы получают сыворотку, инактивируют собственный комплемент и потом одну часть обрабатывают трепонемным антигеном, а другую – кардиолипиновым.Результат оценивают по скорости гемолиза (интенсивность оценивается от ++++ до -). Первый период сифилиса характеризуется отрицательной реакцией Вассермана, у 50% людей она становится положительной не ранее, чем через 2-3 недели после появления твердого шанкра. Во 2 и 3 периоде – 75-90% (+). После успешного лечения – снова отрицательная.

  1. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

Препарат для теста готовят из эритроцитов животных путем сенсибилизации антигеном Treponemapallidum. Клетки добавляют к сыворотке крови пациента. Время проведения теста – 1 час. В присутствии антител происходит реакция агглютинации, а лаборант видит специфические рисунки в микролунках.

  • Расшифровка теста: кольцо из агглютинированных клеток – положительный результат (4+, 3+, 2+);

  • неплотное кольцо – сомнительный результат (+/-, 1+);

  • точка в центре – отрицательный результат (-).

РИТ и РИФ обладают более высокой чувствительность (74–94 и 84–99%) и специфичностью (99 и 97% соответственно). Метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген — антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси бактерий обрабатывают антителами антимикробной диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся с антигенами, отмывают, а оставшиеся антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс антигены + антитела + антиглобулины антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе.

В основе РИБТ лежит способность сыворотки больного сифилисом обездвиживать бледные трепонемы, в то время как сыворотка здоровых людей этой способностью не обладает. Реакция ставится в условиях анаэробиоза.В мировой практике метод РИБТ в настоящее время не применяется.

отрицательный

иммобилизация до 20 % бледных трепонем

слабоположительный

иммобилизация от 21 до 50 % бледных трепонем

положительный

иммобилизация от 51 до 100%

Иммуноблоттинг предполагался как альтернатива РИФ-абс (FTA-ABS) в качестве подтверждающего теста. Он более чувствителен, чем РИФ-абс (FTA-ABS), но менее чувствителен, чем РПГА (ТРРА). Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг — от англ, blot, пятно) из геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов*. На эти полоски наносят сыворотку больного (2). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека (IgMили IgG), меченную ферментом (3). Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под действием фермента.IgG-иммуноблотинг (IgGWesternblot)по чувствительности и специфичности соответствует РИФ-абс.IgM -иммуноблотинг (IgMWesternblot) применяется как диагностический тест при врожденном сифилисе.

В последние годы в отечественную практику лабораторной диагностики сифилиса внедряются стандартизированные высокоинформативные методы серодиагностики – ИФА и РПГА. Принцип ИФА заключается в соединении комплекса АГ-АТ с конъюгатом, содержащим ферментную метку (пероксидаза). После инкубации с субстратом и индикатором оценивают ферментативную активность по интенсивности окраски. РПГА применяется для выявления специфических АТ к T. pallidum в сыворотке крови: при соединении АГ T. pallidum со специфическими АТ в реакции на микропланшете наблюдается феномен агглютинации эритроцитов (плотное кольцо —  положительно, неплотное кольцо – сомнительный результат, точка – отрицательный).

НТТ – отрицательные, ТТ – отрицательные. Подобное сочетание может наблюдаться в следующих случаях:

а) Обследуемый пациент здоров и никогда не страдал сифилисом.

б) Первичный сифилис на первой неделе развития. Показано, что у 30—40 % больных с положительными результатами темнопольной микроскопии определяются отрицательные НТТ и у 25 % — отрицательные ТТ.

в) Больные первичным сифилисом после лечения. Спустя 6—12 месяцев после лечения НТТ становятся отрицательными практически у 98—100 %, а ТТ – у 25—50 % больных.

2.      НТТ – отрицательные, ТТ – положительные. Такое сочетание серологических тестов может наблюдаться при ранних формах манифестного сифилиса после успешного лечения, у больных первичным сифилисом, когда сероконверсия НТТ отстает от таковой при ТТ; при вторичном сифилисе и феномене прозоны; при позднем нелеченом сифилисе НТТ бывают отрицательными у 20—40 % больных; при биологически ложноположительных ТТ, наблюдающихся у больных аутоиммунными заболеваниями, у онкологических и инфекционных больных, у беременных; в терминальной стадии ВИЧ-инфекции.

3.      НТТ – положительные, ТТ – отрицательные. Это сочетание чаще всего встречается при биологически ложноположительных серологических реакциях у названных контингентов больных аутоиммунными, онкологическими и инфекционными заболеваниями, лепрой, а также у лиц преклонного возраста и наркоманов.

4.      Сочетание положительных НТТ и ТТ наблюдается у нелеченых больных сифилисом в любой стадии инфекции, у леченых больных поздним сифилисом, серорезистентным сифилисом, при других трепонематозах (фрамбезия, беджель, пинта), при боррелиозе, ложноположительные НТТ и ТТ — у больных системной красной волчанкой и другими заболеваниями с аномальной или избыточной продукцией антител.

В настоящее время разрабатываются новые диагностические методы, основанные на выявлении молекулярных маркеров органных поражений при сифилисе методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ-МС). Привлечение в арсенал методов лабораторной диагностики сифилиса ГХ-МС позволяет с высокой степенью достоверности определить наличие T. pallidum в организме по наличию специфического молекулярного маркера. В соответствии с данными исследованиями было показано, что биохимический состав сыворотки крови больных сифилисом отличается от сыворотки здоровых доноров. В сыворотке крови больных сифилисом присутствуют липидные, углеводные и аминокислотные компоненты, которые могут служить молекулярными маркерами присутствия T. pallidum в организме (К.А.Осман, 2004). Также методом ГХ-МС были установлены химические соединения, являющиеся молекулярными маркерами органных поражений на ранних стадиях заболевания. По данным исследования К.А. Осман (2004 г.), такими соединениями при поражении ЦНС являются D-галактоза, D-трентол, глюкоза и ее циклический изомер – инозитол, при поражении печени – ароматические производные жирных кислот (фенилпропионовая и фенилуксусная кислота), аминокислотные фрагменты, липидно-белковый комплекс, при поражении костей – летучие жирные кислоты, липополисахариды. Таким образом, привлечение в диагностический арсенал методов газовой хроматографии и масс-спектрометрии позволяет с высокой степенью достоверности определить наличие поражения органов и систем при отсутствии положительных серологических реакций и выраженных клинических проявлений болезни.

Новые методы (журнал Вестник дерматологии и венерологии).

Получение рекомбинантного белка ТрF1, цитоплазматического бактериоферритина T. pallidum, и исследование его иммуногенности на образцах сыворотки крови, полученных от больных различными формами сифилитической инфекции и от здоровых добровольцев. Проведена гетерологическая экспрессия белка ТрF1 в клетках E. coli и очистка полученного ТрF1 с помощью аффинной хроматографии на металл-хелатном сорбенте. Далее рекомбинантный ТрF1 использовали в качестве антигена для определения специфических IgG к исследуемому белку в сыворотках крови больных первичным, вторичным, и ранним/ поздним скрытым сифилисом. Показано, что антитела к ТрF1 обнаруживаются на всех стадиях сифилиса, однако их уровень у больных вторичным, ранним и поздним скрытым сифилисом статистически достоверно отличался от такового в группе здоровых добровольцев. Наибольшее различие было отмечено в группах скрытого сифилиса. Полученные данные характеризуют белок ТрF1 как перспективный антиген для диагностики сифилитической инфекции. Кроме этого, ТрF1 можно расценивать как потенциальный антиген для проведения диференцированной диагностики скрытых форм сифилиса.

Иммуноферментный анализ (ИФА) белка ТрF1 на выборке сывороток крови больных сифилисом и здоровых добровольцев. Для исследования иммуногенности белка ТрF1 были применены образцы сыворотки крови следующих групп больных: 20 больных первичным сифилисом, 21 больного вторичным сифилисом, 20 больных скрытым ранним сифилисом и 16 больных скрытым поздним сифилисом. В качестве группы контроля применяли сыворотку крови (9 образцов) здоровых добровольцев, не имевших в анамнезе указаний на заболевание сифилисом и показавших отрицательные результаты исследования.

С использованием методов генной инженерии разработана технология получения рекомбинантного варианта новых целевыхбелков T. pallidum Tp0453 и Tp0319. Белок Tp0453 является гипотетическим белком наружной мембраны возбудителя сифилиса. Данный белок представляет интерес для серодиагностики си- филиса в связи с предполагаемой локализацией на наружной мембране возбудителя, высокой иммуногенностью и отсутствием гомологов среди бактерий других родов. Белок Тр0319 (TmpC, PnrA) — мембранный липопротеин T. pallidum, предположительно ABC-транспортный белок. Предположительно данный липопротеин является заякоренным во внутренней мембране посредством липидной части молекулы.

В соответствии с разработанной технологией были получены очищенные рекомбинантные белки T. pallidum Tp0319 и Tp0453. Эти белки были использованы в качестве антигенов в составе твердофазного иммуносорбента для выявления специфических IgG к исследуемому белку в сыворотке крови больных с разными формами приобретенного сифилиса. Применение полученного рекомбинантного белка позволило выявить антитела к T. pallidum в сыворотке крови больных сифилисом (первичным, вторичным, скрытым ранним и поздним). При исследовании образцов сыворотки крови, полученных от здоровых доноров, антитела не обнаруживались. Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о возможности использования полученного рекомбинантного белка Тр0319 в качестве дополнительного антигена при диагностике сифилиса. Включение нового антигена в состав иммуносорбента тест-систем для диагностики сифилиса (в формате иммуноферментного анализа, иммуноблотинга) расширяет возможности серологической диагностики данного заболевания за счет увеличения спектра определяемых антител к T. pallidum.

Источник: StudFiles.net

Реакция вассермана микробиология

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте как обрабатываются ваши данные комментариев.

Adblock
detector